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        動物研究所合作發現修復基因印記異常大幅提高動物克隆效率

          體細胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)是指通過顯微操作,將單個體細胞的細胞核移植到去核的卵母細胞中的技術過程。卵母細胞的細胞質能將體細胞核轉變為 “全能狀態”,并發育成為完整的動物。希臘文“Klone”指的是通過扦插枝條來對植物無性繁殖的方法。由于與扦插繁殖有類似性,體細胞核移植也被稱為動物克隆(Cloning)。

          扦插到土壤中的枝條能否生根,是它是否能夠成長為扦插植物的關鍵步驟。對于克隆胚胎來說,“生根”意味著在代孕母體的子宮內著床,進而形成有功能的胎盤。2006年,動物研究所周琪課題組合作發現,盡管小鼠克隆胚胎的著床前發育率可達相當水平,但其移植后的“生根”過程,即著床后的發育存在顯著的異常,而這些異常主要體現在胚外組織(Extraembryonic tissues,主要形成胎盤)的發育異常1。受限于研究手段,當時難以對克隆胎盤缺陷的本質做進一步闡釋。

          2017年,利用人工構建的孤雌和孤雄胚胎和早期胚胎測序技術,哈佛大學張毅實驗室發現了H3K27me3控制的印記(親本特異性單等位表達)蛋白編碼基因,其中四個(Sfmbt2,Gab1,Smoc1,Jade1)在胎盤中受H3K27me3印記,在胎兒中不印記(雙等位表達)2。核移植重編程無法修正印記的缺陷。例如,對原始生殖細胞(不具備完整印記)進行克隆,無法獲得具備完整印記的胚胎,也無法得到動物。一般認為,只有“印記正常”的供體細胞才能夠被成功克隆。與很多情況下一樣,對基礎知識的更新挑戰了“一般認知”:既然體細胞沒有H3K27me3印記,也許所有的克隆胎盤都是“印記異常”的?這些異常對克隆胎盤的缺陷有什么貢獻?

          在本研究中,研究團隊鑒定了克隆胚胎的H3K27me3印記基因表達情況。和預期一致,這些基因在克隆胎盤中存在過度表達。要進一步證實這種過度表達對克隆缺陷的作用,則需要在供體細胞中單等位敲除四個H3K27me3印記基因。利用傳統手段無法在細胞中一次性實現四個基因的單等位敲除,因此研究人員利用小鼠單倍體干細胞作為敲除載體,利用基因編輯技術成功獲得了攜帶四個H3K27me3印記基因單等位敲除的體細胞:胚胎成纖維細胞。結果顯示,這四個基因的敲除極大的提高了體細胞克隆的效率,從0%(移植404枚野生型克隆胚胎出生0只)提高到最高14.2%(移植49枚四敲除克隆胚胎出生7只,實驗共獲得攜帶H3K27me3印記基因敲除的克隆小鼠39只)。

          進一步研究發現,攜帶這四個基因的敲除的實驗組克隆小鼠的體重與受精卵來源的小鼠一致,而對照組克隆小鼠的體重顯著高于受精卵來源的小鼠。同時,實驗組克隆小鼠的胎盤直徑和重量也顯著低于對照組克隆小鼠,與受精卵來源的小鼠一致。切片分析發現,這四個H3K27me3印記基因敲除之后,克隆胎盤的滋養層比例顯著提升。滋養層提供胎兒與母體之間的物質交換,是胎盤“扎根”在子宮中的重要組成部分,也是胚胎正常發育的基礎。野生型克隆小鼠的胎盤較大,可能在一定程度上保證了低滋養層比例下克隆胎兒的營養和氣體交換。以上結果表明胎盤中H3K27me3印記基因異常(雙等位表達)是克隆動物胎盤異常的重要因素。

          攜帶四個H3K27me3印記基因單等位敲除的克隆小鼠可以正常存活至成年,且這些成體小鼠的體細胞(尾尖成纖維細胞)在克隆中也展現出與胚胎成纖維細胞類似的克隆效率與表型的改善。這說明H3K27me3印記基因的單等位敲除對于克隆的提升不受供體細胞年齡的限制。通過將這些成體小鼠與野生型小鼠交配和基因分離,得到了四種攜帶不同單H3K27me3印記基因單等位敲除的小鼠。進一步克隆這些體細胞,發現Sfmbt2在提高克隆效率,增大滋養層比例上具有最大貢獻,而Smoc1或Jade1敲除也在改善著床后發育上有不同程度的貢獻。

          2010年,Ogura實驗室報道單等位敲除Xist能顯著提高小鼠克隆效率3。實驗發現,盡管Xist基因在克隆胎盤中也有過表達,但在提高成纖維細胞的克隆效率上,Xist敲除不如H3K27me3印記基因四敲除(或Sfmbt2單敲除)的效果顯著。研究顯示,小鼠的Xist印記同樣依賴于胎盤特異的H3K27me3修飾4,這些結果說明,異常的Xist印記可能也屬于本研究所揭示的H3K27me3印記依賴的體細胞克隆障礙。本研究結果顯示,胎盤的H3K27me3印記異常可能在體細胞克隆胚胎中廣泛存在,是克隆胎盤過大這一常見克隆動物發育缺陷的重要貢獻因素;修復胎盤中H3K27me3印記基因的表達異常能夠恢復克隆小鼠的體重,支持了“克隆動物的胎兒過大,起因是克隆動物的胎盤過大”這一經典假設;找到了提高克隆效率貢獻度最大的H3K27me3印記基因Sfmbt2;由于成纖維細胞是豬、牛、猴等大動物克隆中的廣泛使用的供體細胞,本研究的結論可能具有廣泛的應用前景。

          此研究由中國科學院動物研究所、干細胞與再生醫學創新研究院與中國科學院遺傳與發育生物學研究所等機構合作完成。中國科學院動物研究所、干細胞與再生醫學創新研究院周琪研究員、李偉研究員及中國科學院遺傳與發育生物學研究所陸發隆研究員為文章的共同通訊作者。中國科學院動物研究所博士后王樂韻、李治琨、王立賓,博士生劉超、孫雪寒以及副研究員馮桂海為本文的共同第一作者。研究受科技部、國家自然科學基金委、中國科學院、博士后基金等項目的資助。

          文章鏈接:https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(20)30212-5

        修復H3K27me3印記異常能提高克隆效率、改善克隆小鼠和克隆胎盤的發育表型

          參考文獻:

          1 Jouneau, A. et al. Developmental abnormalities of NT mouse embryos appear early after implantation. Development 133, 1597-1607, doi:10.1242/dev.02317 (2006).

          2 Inoue, A., Jiang, L., Lu, F. L., Suzuki, T. & Zhang, Y. Maternal H3K27me3 controls DNA methylation-independent imprinting. Nature 547, 419-424, doi:10.1038/nature23262 (2017).

          3 Inoue, K. et al. Impeding Xist expression from the active X chromosome improves mouse somatic cell nuclear transfer. Science 330, 496-499, doi:10.1126/science.1194174 (2010).

          4 Inoue, A., Jiang, L., Lu, F. L. & Zhang, Y. Genomic imprinting of Xist by maternal H3K27me3. Gene Dev 31, 1927-1932, doi:10.1101/gad.304113.117 (2017).

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